1 近期，由日本学者发表在VETERINARY RESEARCH上的一篇《Antiviral activity of itraconazole against type I feline coronavirus infection》，在兽医圈引起了轰动。 伊曲康唑，属于抗真菌成分，但该研究证明，它在细胞中能表现出抗病毒作用，也许能用于治疗 I 型FCoV感染，成为治疗猫传腹的药物！
猫冠状病毒（FCoV）是有囊膜的正链RNA病毒，存在两种血清型：I 型FCoV和 II 型FCoV。I 型更有可能引起FIP，临床上由 Ⅱ 型引起的FIP仅占2-30%。现在有很多针对FIP的抗病毒药物和疫苗正在研究中，但尚未投入临床实践。 伊曲康唑（ICZ）被归类为咪唑类抗真菌药。低毒、安全，在兽医被用于治疗犬猫的真菌感染。最近，有报道称ICZ对肠道病毒感染（脊髓灰质炎病毒，鼻病毒和柯萨奇病毒）有效。本文作者之前已研究过胆固醇转运抑制剂（包括U18666A）的抗病毒作用，并证实ICZ可以抑制 I 型FCoV感染，但对ICZ治疗FCoV感染的效果尚未进行详细研究。因此在这项研究中重点关注于ICZ对FCoV的抗病毒作用。
试验内容 1 WST-8法测定细胞存活率，评估ICZ对fcwf-4细胞的细胞毒性作用 fcwf-4细胞对 I 型FIPV、 II 型FIPV和 II 型FECV都很敏感。细胞毒性百分比的计算公式为：细胞毒性（％）= 100 - [（ICZ处理组细胞的OD / ICZ未处理组细胞的OD）]×100。 ICZ 的CC50和CC10分别为208.0±22.9（平均值±SE）μM和1.1±0.4（平均值±SE）μM（图1 ）。 图1 ICZ在fcwf-4细胞中的细胞毒性作用 黑色圆圈表示用ICZ处理的细胞，白色圆圈表示未用ICZ处理的对照组细胞。 空斑减数试验，研究使用ICZ对FCoV感染fcwf-4细胞的影响 病毒蛋白表达试验，进一步评估ICZ对FCoV感染力的影响 空斑抑制试验测定在FIPV-1 KU2感染fcwf-4细胞后再使用ICZ的效果 空斑减数率（％）= 100 - [（ICZ处理组空斑数）/（ICZ未处理组空斑数）]×100。研究结果表明，ICZ可以降低I型FCoVs的感染力，且呈剂量依赖型（图2A）。0.03-20μM的ICZ即能抑制I型FCoV的噬斑形成。但是，ICZ对II型FCoV的感染力影响很轻微。 基于空斑减数试验和细胞毒性测定的结果，ICZ对每种病毒的IC50（半数抑制浓度）和SI（CC50半数死亡浓度）/ IC50）显示在表1中 。 对病毒滴度进行测定可知，ICZ可以抑制 I 型FCoV的产生，且有剂量依赖性。而ICZ对 II 型FCoV的效果不太明显。（图2B） 通过免疫荧光（IFA）测定核衣壳蛋白水平。在用ICZ预处理的fcwf-4细胞中，FIPV-1KU2的N蛋白水平显著降低。但是ICZ预处理并没有影响FIPV-II 79-1146的N蛋白水平（图2C）。 通过空斑抑制试验测定在FIPV-1 KU2感染fcwf-4细胞后再使用ICZ的效果。结果显示，在感染前或感染后使用ICZ都能起到对FIPV-1 KU2很好的抑制作用（图2D）。但是对FIPV-II 79-1146的抑制作用很轻微。 图2.ICZ对I型FIPV和II型FIPV的抗病毒作用 A.空斑减数试验。黑色表示ICZ处理组数据，白色表示对照组数据。结果表示为平均值±SE。数据来源于四个各自独立的实验。与对照组相比，*p <0.05。 B.ICZ在fcwf-4细胞中抑制FCoV感染。黑色表示ICZ处理组数据，白色表示对照组数据。结果表示为平均值±SE。数据来源于四个各自独立的实验。与对照相比，* p<0.05。 C. 通过IFA来评估ICZ对FCoV核衣壳蛋白表达的影响。数据来源于三个各自独立的实验。 D.感染后使用ICZ的抗病毒效果。KU2：FIPV-1KU2菌株，UCD1：FIPV-1 UCD1菌株，UCD4：FIPV-1 UCD4菌株，1146：FIPV-II WSU 79-1146菌株，ICZ：伊曲康唑。 对fcwf-4进行flipin-cholesterol染色，用莱卡显微镜和LAS X集成成像系统进行分析；用Amplex Red Cholesterol检测试剂盒测定细胞内胆固醇数量。评估ICZ对fcwf-4细胞的胆固醇蓄积和细胞内胆固醇水平的影响 胆固醇转运抑制剂U18666A可以强有力地抑制I型FCoVs感染。曾有报道称ICZ可抑制细胞内胆固醇的转运，作用机制与U18666A类似。 本试验对fcwf-4进行flipincholesterol染色，用莱卡显微镜和LAS X集成成像系统进行分析可知，ICZ与U18999A相似，能够诱导细胞内胆固醇的蓄积（图3A）。用Amplex Red Cholesterol检测试剂盒测定细胞内胆固醇数量可知，2.5μM和20μM的ICZ对细胞内胆固醇水平的降低效果均与2.0μM的U18666A一致（图3B）。 图3.ICZ对fcwf-4细胞的胆固醇蓄积和细胞内胆固醇水平的影响 A.ICZ诱导细胞内胆固醇蓄积。白色箭头指示的内容是白色方框的放大图。 B.对 fcwf-4细胞的细胞内胆固醇进行定量。数据来源于三个各自独立的实验。 在猫冠状病毒的2种血清型中，ICZ能够抑制 I 型FCoV感染。大约70-90％患有FIP的猫感染的是 I 型FCoV，将ICZ作为抗FIPV药使用可能是有效的。另一方面，ICZ不影响 II 型FCoV，表明ICZ的抗病毒作用根据FCoV的血清型不同而不同。 本研究结果显示，对于确诊患有FIP的猫，按照10mg/kg，一日2次，服用ICZ，可以降低病毒载量。但是长期连续使用高剂量ICZ，会导致血液丙氨酸氨基转移酶增加，指示肝脏受损，但在停止给药后这种症状能够恢复。 之前曾报道过U18666A通过作用于NPC1来抑制胆固醇转运和 I 型FIPV感染。该研究证实了ICZ可以抑制细胞内胆固醇转运。大家对ICZ引起细胞质中胆固醇蓄积已经有了一些研究，但机制尚未清晰。最近有报道称，ICZ通过作用于NPC1使溶酶体中的胆固醇蓄积。根据该报告，ICZ可以通过与U18666A相同的机制来抑制 I 型FCoV的复制。另外，ICZ通过作用于NPC1以外的蛋白质来抑制I型FCoV以外的病毒的感染。 本研究证实ICZ可以抑制 I 型FIPV的感染，也许可用作治疗FIP的药物。FIP是一种多因素疾病，与FCoV的毒力、宿主免疫状态、病毒感染途径等都相关。 不过该结论仅针对于本试验研究，还未在临床上被实践应用。感兴趣的医生们可以尝试给药~
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